為了避免污染造成的損失，最小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變，以及避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳動(dòng)物細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。凍存細(xì)胞應(yīng)做好標(biāo)記和歸檔，以便后續(xù)使用。
①計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長期。
②1200rpm，離心5min沉淀細(xì)胞，使用移液管去除上清。
③以5×106~1×107cell/mL密度，在凍存液中再次重懸細(xì)胞。
④分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于4℃冰箱中15~30分鐘。
⑤將凍存管放入程序凍存盒中，-80℃冰箱過夜后，轉(zhuǎn)移到液氮中貯存
①按照傳代操作消化細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。
②800~1000rpm，離心5min沉淀細(xì)胞，使用移液管去除上清。
③以1×106~5×106cell/mL的密度，在凍存液中重懸細(xì)胞。
④將細(xì)胞分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于4℃冰箱中15~30分鐘。
⑤將凍存管放入程序凍存盒中，-80℃冰箱過夜后，轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
按照ATCC提供的細(xì)胞凍存液配方，在凍存前配制即可。
凍存的細(xì)胞應(yīng)做好標(biāo)記，并記錄貯存位置，方便后續(xù)查找并使用
凍存細(xì)胞比較脆弱，需要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并且直接添加到完全培養(yǎng)基中，離心后去除凍存液培養(yǎng)，避免DMSO或其他成分對(duì)細(xì)胞生長造成影響。
①取出貯存的細(xì)胞，37℃水浴鍋中快速融化。
②直接用完全培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)至12~24小時(shí)，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，去除凍存劑。（某些細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞，復(fù)蘇后為避免細(xì)胞損傷不能離心，采取直接鋪板法。）
①取出貯存的細(xì)胞，37℃水浴鍋中快速融化。
②把1mL凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至9mL完全培養(yǎng)基中，1000rpm，離心5min收集細(xì)胞。
③去除含有凍存液的上清
④用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中。
凍存及復(fù)蘇流程應(yīng)按照“慢凍速融”原則。
操作過程嚴(yán)格保證無菌：融化細(xì)胞時(shí)水面不能沒過管口；將細(xì)胞拿進(jìn)超凈工作臺(tái)時(shí)，用酒精噴霧或酒精棉消毒凍存管表面。
完全培養(yǎng)基應(yīng)提前恢復(fù)至室溫，并分裝備用。
24h后：對(duì)于貼壁細(xì)胞，確定是否貼壁，并估算存活率；對(duì)于懸浮細(xì)胞，檢查外形（胞質(zhì)透明度，顆粒度）。
凍存液的特性：常用的凍存液是DMSO（二甲基亞砜）。可防止在低溫（零度以下至-196℃）保存細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷。但是DMSO對(duì)細(xì)胞有毒性，細(xì)胞復(fù)蘇后要快速去除。
細(xì)胞株對(duì)應(yīng)的最適凍存配方需參考說明書、ATCC或文獻(xiàn)。
部分無血清培養(yǎng)的細(xì)胞，凍存液也要用無血清的，例如BEAS-2B。
部分細(xì)胞使用商品化的無血清凍存液后，復(fù)蘇存活率較低，推薦測(cè)試后再使用。
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